Transcrição reversa na determinação da expressão do mRNA para a enzima conversora de angiotensina testicular em animais tratados com zinco
Palavras-chave:
dieta, enzima conversora de angiotensina, expressão gênica, reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa, zincoResumo
Objetivo
O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições reacionais capazes de ocasionar variabilidade e de introduzir erros sistemáticos na reação em cadeia pela polimerase aplicada à análise da expressão gênica da isoforma testicular da enzima conversora de angiotensina.
Métodos
Avaliaram-se a concentração de cDNA, a concentração dos iniciadores, a temperatura de hibridização e o número de ciclos de desnaturação, hibridização e extensão. Para tanto, extraiu-se o RNA total por meio da reação com fenol-clorofórmio e isotiocianato de guanidina de amostras de testículos de ratos Wistar alimentados com uma ração contendo zinco. Em seguida, gerou-se o cDNA por transcrição reversa. Utilizando-se iniciadores específicos, amplificaram-se o gene de interesse (isoforma testicular da enzima conversora de angiotensina) e o gene controle Gliceraldeído-3-Fosfato-Desidrogenase. As amostras foram então aplicadas em gel de agarose e submetidas à eletroforese, coradas em brometo de etídio e visualizadas sob luz ultravioleta.
Resultados
Demonstrou-se que a melhor condição reacional para a reação em cadeia pela polimerase da isoforma testicular da enzima conversora de angiotensina e do Gliceraldeído-3-Fosfato-Desidrogenase foi: (1) concentração inicial de cDNA de 2µg, (2) concentração de iniciadores de 200nM, (3) temperatura de hibridização entre 57,5°C e 60,1°C e (4) 33 ciclos.
Conclusão
Com essa otimização pôde-se minimizar as interferências sobre a técnica, contribuindo-se para a obtenção de dados comparativos a respeito da expressão gênica da enzima conversora de angiotensina testicular.
Referências
Henriques GS, Hirata MH, Cozzolino, SMF. Aspectos recentes da absorção e biodisponibilidade do zinco e suas correlações com a fisiologia da isoforma testicular da Enzima Conversora de Angiotensina. Rev Nutr. 2003; 16(3):333-45.
Blanchard RK, Cousins RJ. Diferencial display of intestinal mRNA’s regulated by dietary zinc. Proc Acad Sci USA. 1996; 93:6863-8.
Blanchard RK, Cousins RJ. Regulation of intestinal gene expression by dietary zinc: induction of uroguanylin mRNA by zinc deficiency. J Nutr. 2000; 130(5 Suppl):1393S-98S.
Stallard L, Reeves PG. Zinc deficiency in adult rats reduces the relative abundance of testis-specific angiotensin-converting enzyme mRNA. J Nutr. 1997; 127(1):25-9.
Strittmatter SM, Thiele EA, De Souza EB, Snyder SH. Angiotensin-converting enzyme in the testes and epididymis: differential development and pituitary regulation of isozymes. Endocrinology. 1985; 117(4):1374-9.
Ehlers MR, Fox EA, Strydom DJ, Riordan JF. Molecular cloning of human testicular angiotensin- converting enzyme: the testis isozyme is identical to the C-terminal half of endothelial angiotensin- converting enzyme. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(20):7741-5.
Siebert P. The PCR technique: RT-PCR. BioTechniques Books, Eaton Publishing; 1998.
Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 1993; 123(11):1939-51.
Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extractcion. Anal Biochem. 1987; 162(1):156-9.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor (CSH); 1989. v.1. cap. 7 – Extraction, purification and analysis of messenger RNA from eukaryotic cells. p. 7.3-7.87
Ramaraj P, Kessler SP, Colmenares C, Sen GC. Selective restoration of male fertility in mice lacking angiotensin-converting enzymes by sperm-specific expression of the testicular enzyme. J Clin Invest. 1998; 102(2):371-8.
Tokunaga K, Nakamura Y, Sakata K, Fujimori K, Okubo M, Sawada S. Enhanced expression of a glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene in human lung cancers. Cancer Res. 1987; 47(21):5616-9.
Spencer WE, Christensen MJ. Multiplex relative RT-PCR method for verification of differential gene expression. BioTechniques. 1999; 27(5):1044-6, 1048-50, 1052
Kessler SP, Rowe TM, Blendy JA, Erickson RP, Sen GC. A cyclic AMP response element in the angiotensin-converting enzyme gene and the transcription factor CREM are required for transcription of the mRNA for the testicular isozyme. J Biol Chem. 1998; 273(16):9971-5
Stallard L, Reeves PG. Zinc deficiency in adult rats reduces the relative abundance of testis-specific Angiotensin-converting enzyme mRNA. J Nutr. 1997; 127(1): 25-9
Sullivan VK, Burnett FR, Cousins RJ. Metallothionein expression is increased in monocytes and erythrocytes of young men during zinc supplementation. J Nutr. 1998; 128(4): 707-13.
Reeves PG, Rossow KL. Zinc deficiency affects the activity and protein concentration of angiotensin--converting enzyme in rat testes. Proc Soc Exp Biol Med. 1993; 203(3):336-42.
Downloads
Publicado
Como Citar
Edição
Seção
Licença
Copyright (c) 2023 Gilberto Simeone HENRIQUES, Adriana Gisele Hertzog da SILVA, Rosário Dominguez Crespo HIRATA, Mario Hiroiuki HIRATA, Sílvia Maria Franciscato COZZOLINO
Este trabalho está licenciado sob uma licença Creative Commons Attribution 4.0 International License.
